Princip experimentu
Elektroforéza hemoglobinu má za cíl detekovat a potvrdit různé normální a abnormální hemoglobiny.
Vzhledem k různým nábojům a izoelektrickým bodům různých typů hemoglobinu, v určitém pufrovacím roztoku s pH, kdy je izoelektrický bod hemoglobinu nižší než pH pufrovacího roztoku, nese hemoglobin negativní náboj a během elektroforézy migruje směrem k anodě. Naopak hemoglobin s kladným nábojem se pohybuje směrem ke katodě.
Při určitém napětí a po určité době elektroforézy vykazují hemoglobiny s různým nábojem a molekulovou hmotností různé směry a rychlosti migrace. To umožňuje oddělení odlišných zón a následná kolorimetrická nebo elektroforetická skenovací analýza může být provedena na těchto zónách pro kvantifikaci různých hemoglobinů. Nejčastěji používanou metodou je membránová elektroforéza z acetátu celulózy o pH 8,6.
V cytoplazmě jsou ethylenglykolové skupiny (CHOH-CHOH) přítomné v glykogenových nebo polysacharidových látkách (jako jsou mukopolysacharidy, mukoproteiny, glykoproteiny, glykolipidy atd.) oxidovány kyselinou jodistou a přeměněny na aldehydové skupiny (CHO-CHO). Tyto aldehydové skupiny se spojují s bezbarvým purpurově červeným Schiffovým činidlem a tvoří purpurově červené barvivo, které se ukládá tam, kde jsou v buňce přítomny polysacharidy. Tato reakce je známá jako barvení kyselinou periodickou-Schiff (PAS), dříve označované jako barvení glykogenem.
Experimentální metoda
Materiály:Acetát celulózypambrane, elektroforetický přístroj(DYCP-38C a napájecí zdroj DYY-6C), Vynikající nástroj pro načítání vzorků (pipeta), spektrofotometr, kolorimetrické kyvety, nárazníky.
Vyrovnávací paměť:
(1) pH 8,6 TEB pufr: Naváží se 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g kyseliny borité a přidá se destilovaná voda do 1000 ml.
(2) Borátový pufr: Naváží se 6,87 g boraxu a 5,56 g kyseliny borité a přidá se destilovaná voda do 1000 ml.
Postup:
Poprava roztoku hemoglobinu
Vezměte 3 ml krve obsahující heparin nebo citrát sodný jako antikoagulant. Centrifugujte při 2000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut a plazmu zlikvidujte. Promyjte červené krvinky třikrát fyziologickým roztokem (750 otáček za minutu, pokaždé 5 minut odstřeďování). Centrifugujte při 2200 otáčkách za minutu po dobu 10 minut a odstraňte supernatant. Přidejte stejné množství destilované vody a poté přidejte 0,5násobek objemu tetrachlormethanu. Intenzivně protřepávejte po dobu 5 minut a poté odstřeďujte při 2200 ot./min po dobu 10 minut, abyste shromáždili horní roztok Hb pro pozdější použití.
Namáčení membrány
Membránu z acetátu celulózy nařežte na proužky o rozměrech 3 cm × 8 cm. Namočte je do TEB pufru o pH 8,6 až do úplného nasycení, poté vyjměte a osušte filtračním papírem.
špinění
Pomocí pipety naneste 10 μl roztoku hemoglobinu svisle na membránu z acetátu celulózy (hrubá strana), asi 1,5 cm od okraje.
Elektroforéza
Nalijte roztok borátového pufru do elektroforetické komory. Umístěte membránu z acetátu celulózy bodovou stranou na katodový konec komory. Nechejte běžet při 200 V po dobu 30 minut.
Eluce
Vyřízněte zóny HbA a HbA2, vložte je do samostatných zkumavek a přidejte 15 ml a 3 ml destilované vody. Jemně protřepejte, aby se hemoglobin úplně eluoval, a poté promíchejte.
Kolorimetrie
Vynulujte absorbanci použitím destilované vody pro eluční roztok a změřte absorbanci při 415 nm.
Výpočet
HbA2(%) = Absorbance zkumavky HbA2 / (Absorpce zkumavky HbA × 5 + Absorbance zkumavky HbA2) × 100 %
Výpočet experimentálních výsledků
Referenční rozsah pro pH 8,6 TEB Buffer Elektroforéza acetát celulózy: HbA > 95 %, HbA2 1 %-3,1 %
Poznámky
Doba elektroforézy by neměla být příliš dlouhá. Membrána z acetátu celulózy by neměla během elektroforézy vyschnout. Zastavte elektroforézu, když jsou HbA a HbA2 jasně odděleny. Prodloužená elektroforéza může způsobit difúzi a rozmazání pásu.
Vyvarujte se použití příliš velkého množství vzorku. Nadměrná hladina hemoglobinu může vést k oddělení proužku nebo nedostatečnému zabarvení, což má za následek falešně zvýšené hladiny HbA.
Zabraňte kontaminaci membrány z acetátu celulózy proteiny.
Proud by neměl být příliš vysoký; jinak se hemoglobinové pásy nemusí oddělit.
Vždy zahrňte vzorky od normálních jedinců a nezbytné známé abnormální hemoglobiny jako kontroly.
Beijing Liuyi Biotechnology vyrábí profesionální elektroforézní nádrž pro elektroforézu hemoglobinu, která je modelemDYCP-38Cnádrž pro elektroforézu s membránou z acetátu celulózy a pro nádrž pro elektroforézu s membránou z acetátu celulózy jsou k dispozici dva modely napájecího zdroje pro elektroforézuDYY-2CaDYY-6Cnapájení.
Mezitím Beijing Liuyi Biotechnology poskytuje zákazníkům membránu z acetátu celulózy a velikost membrány z acetátu celulózy lze přizpůsobit. Vítejte a zeptejte se nás na vzorky a další informace.
Značka Beijing Liuyi má v Číně více než 50letou historii a společnost může poskytovat stabilní a vysoce kvalitní produkty po celém světě. Během let vývoje stojí za vaši volbu!
Nyní hledáme partnery, vítáme jak OEM elektroforézu, tak distributory.
Pokud máte nějaký plán nákupu pro naše produkty, neváhejte nás kontaktovat. Můžete nám poslat zprávu na email[e-mail chráněný]nebo[e-mail chráněný]nebo nám zavolejte na číslo +86 15810650221 nebo přidejte Whatsapp +86 15810650221 nebo Wechat: 15810650221
Čas odeslání: 20. září 2023